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蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定
来源:甘肃中医药大学--理化实验教学中心网  发布日期: 2015-6-14  阅读次数:160  
 

蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定

一、实验目的

1、掌握从鲜鸡蛋中提取卵磷脂的方法与原理。

2、卵磷脂鉴定的方法与原理。

3、加深了解磷脂类物质的结构和性质。

二、实验内容

磷脂是一类含有磷酸的脂类,机体中主要含有两大类磷脂,由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂(phosphoglyceride);由神经鞘氨醇构成的磷脂,称为鞘磷脂(sphingolipid)。其结构具有由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)构成的亲水头(hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobic tail)。在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面,而疏水尾位于膜内侧。磷脂是重要的两亲物质,它们是生物膜的重要组分、乳化剂和表面活性剂。

磷脂依照氨基醇的不同可分:(1)磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC),分布:植物主要有大豆等,动物主要有脑、精液、肾上腺、红细胞,蛋卵黄(8-10%)。其主要作用是控制肝脂代谢,防止脂肪肝的形成;(2)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE),参与血液凝结;(3)、磷脂酰丝氨酸(PS);(4)、 磷脂酰肌醇(PI);(5)、 磷脂酰甘油(PG);(6)、二磷脂酰甘油(心磷脂)。

蛋黄磷脂属动物胚胎磷脂,含有大量的胆固醇和甘油三酯及许多人体不可缺少的营养物质和微量元素。卵磷脂是生命的基础物质,人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中,更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂也被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒,这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用,而不会使血浆中的胆固醇增加。

三、实验原理、方法和手段

原理一:卵磷脂是生物体组织细胞的重要成分,主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心、卵等组织中,尤其在蛋黄中含量较多(10%左右)。卵磷脂和脑磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮,利用此性质可将其与中性脂肪分离开;卵磷脂能溶于乙醇而脑磷脂不溶,利用此性质又可将卵磷脂和脑磷脂分离。

原理二:卵磷脂为白色,当与空气接触后,其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。甘油与硫酸氢钾共热,可生成具有特殊臭味的丙烯醛;磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵作用,生成黄色的磷钼酸沉淀;胆碱在碱的进一步作用下生成无色且具有氨和鱼腥气味的三甲胺。这样通过对分解产物的检验可以对卵磷脂进行鉴定。

四、实验仪器、试剂

1、实验材料:鲜鸡蛋

2、仪器与器皿:蛋清分离器、恒温水浴锅、蒸发皿(每组一个)、漏斗(每组一个)、铁架台、磁力搅拌器(每组一个)、天平、25mL量筒(每组一个)、100mL量筒(每组一个)、干燥试管(每组四支)、玻棒2支、小烧杯大小各2个。

3、试剂:95%乙醇(每组50mL)、乙醚(每组20mL)、丙酮(每组30mL)、ZnCl2、无水乙醇(每组40mL)、滤纸(2张)、10%氢氧化钠(每组30mL)、3% 溴的四氯化碳溶液(每组10mL)、红色石蕊试纸(每组二张)、3%溴的四氯化碳溶液(每组10mL)、硫酸氢钾(每组10mL)、钼酸铵溶液(每组10mL, 钼酸铵试剂将6g 钼酸铵溶于15mL 蒸馏水中,加入5mL 浓氨水,另外将24mL 浓硝酸溶于46mL的蒸馏水中,两者混合静置一天后再用。)。

五、实验步骤

1)、卵磷脂的提取

蛋黄的制备:用蛋清分离器分离蛋黄。

方法一、蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中,加入95%乙醇40ml,搅拌15min后,静置15min;然后加入10ml的乙醚,搅拌15 min后,静置15min;过滤;滤渣进行二次提取,加入乙醇与乙醚(体积比为31)的混合液30ml,搅拌、静置一定时间;第二次过滤,合并二次滤液,加热浓缩至少量,加入一定量丙酮除杂,卵磷脂即沉淀出来,即得到卵磷脂粗品。

方法二、称取10g 蛋黄于小烧杯中,加入温热的95%乙醇30mL,边加边搅拌均匀,冷却后过滤。如滤液仍然混浊,可再次过滤至滤液透明。将滤液置于蒸发皿内,于水浴锅中蒸干(或用加热套蒸干,温度可设140左右),所得干物即为卵磷脂。

(为了减少或尽可能不用乙醚,实验采用方法二。)

2)、卵磷脂的纯化

取一定量的卵磷脂粗品,用无水乙醇溶解,得到约10% 的乙醇粗提液,加入相当于卵磷脂质量的10% ZnCl2水溶液,室温搅拌0.5 h;分离沉淀物,加入适量冰丙酮(4)洗涤,搅拌1h,再用丙酮反复研洗,直到丙酮洗液为近无色止,得到白色腊状的精卵磷脂;干燥;称重。

3)、卵磷脂的溶解性试验

卵磷脂的溶解性:取干燥试管,加入少许卵磷脂,再加入5mL 乙醚,用玻棒搅动使卵磷脂溶解,逐滴加入丙酮35mL,观察实验现象。

4)、卵磷脂的鉴定

4.1 三甲胺的检验

取干燥试管一支,加入少量提取的卵磷脂以及25mL 10%氢氧化钠溶液,放入水浴中加热15min,在管口放一片红色石蕊试纸,观察颜色有无变化,并嗅其气味。将加热过的溶液过滤,滤液供下面检验。

4.2 不饱和性检验

取干净试管一支,加入10滴上述滤液,再加入123% 溴的四氯化碳溶液,振摇试管,观察有何现象产生。

4.3 磷酸的检验

取干净试管一支,加入10滴上述滤液和51095%乙醇溶液,然后再加入5~10滴钼酸铵试剂,观察现象;最后将试管放入热水浴中加热510min,观察有何变化。

4.4 甘油的检验

取干净试管一支,加入少许卵磷脂和0.2g 硫酸氢钾,用试管夹夹住并先在小火上略微加热,使卵磷脂和硫酸氢钾混熔,然后再集中加热,待有水蒸气放出时,嗅有何气味产生。

六、思考题与作业

1) 卵磷酯的用途?

答:卵磷脂是生命的基础物质,人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中,更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂也被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒,这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用,而不会使血浆中的胆固醇增加。具体一些保健功能如下:

保护肝脏:磷脂中的胆碱对脂肪有亲和力,若体内胆碱不足,则会影响脂肪代谢,造成脂肪在肝内积聚,形成脂肪肝甚至会发炎肿胀。卵磷脂不但可以预防脂肪肝,还能促进肝细胞再生,同时,磷脂可降低血清胆固醇含量,防止肝硬化并有助于肝功能的恢复。

健康心脏:在20世纪60年代,科学家们就发现卵磷脂可能具有保护心脏的作用,在进一步的研究中,终于证实卵磷脂对心脏健康有积极作用。这是因为它能调节胆固醇在人体内的含量、有效降低胆固醇、高血脂及冠心病的发病率。

ƒ有益大脑:美国北卡罗来纳州DUKE大学心理学教授药学博士沃伦来克在报告中提到:用卵磷脂饲育怀孕的大鼠,其后代在智力测验(迷宫测试)中,记忆力显著优于未饲育卵磷脂的大鼠的后代。北卡罗来纳大学营养学部教授及主任,会议的首席专家,医学博士、药学博士史蒂文·泽瑟尔在大会贺词中说:“总结有关卵磷脂的所有研究成果,我们应当特别建议怀孕妇女服用适量的卵磷脂,这对于她们的婴儿的智力发育是很重要的。”美国食品与药物管理委员会(FDA)规定,所有婴儿食谱中都要适量补充卵磷脂。

清洁血管:卵磷脂具有乳化、分解油脂的作用,可增进血液循环,改善血清脂质,清除过氧化物,使血液中胆固醇及中性脂肪含量降低,减少脂肪在血管内壁的滞留时间,促进粥样硬化斑的消散,防止由胆固醇引起的血管内膜损伤。服用卵磷脂对高血脂和高胆固醇具有显著的功效,因而可预防和治疗动脉硬化症(高血压、心肌梗塞、脑溢血)。

调整血糖:磷脂不足会使胰脏机能下降,无法分泌充分的胰岛素,不能有效地将血液中的葡萄糖运送到细胞中,这是导致糖尿病的基本原因之一。如每天食用20以上的卵磷脂,则糖尿病的恢复是相当显著的。很多病人甚至可不必再注射胰岛素。特别是对糖尿坏疽及动脉硬化等并发症患者更为有效。

消融结石:体内过多的胆固醇会发生沉淀,从而形成胆结石,胆结石90%是由胆固醇组成。胆汁中的主要成分是卵磷脂,此外还有水份、胆固醇、矿物质及色素等,卵磷脂可以将多余的胆固醇分解、消化及吸收,从而使胆汁中的胆固醇保持液体状。如果每天摄取一定量的卵磷脂可以有效地防止胆结石的形成,并对已形成的胆结石也能起到化解的作用。

神经发育:正常情况下,孕妇体内的羊水中含有大量的卵磷脂。婴幼儿时期是大脑形成发育最关键时期,卵磷脂可以促进大脑神经系统与脑容积的增长、发育。因此美国食品和药物管理局(FDA)规定在婴儿奶粉中必需添加卵磷脂。

养颜润肤:在正常人体内含有许多毒素,特别是在肠道内,当这些毒素含量过高时,便会随着血液循环沉积在皮肤上,从而形成色斑或青春痘。卵磷脂正好是一种天然的解毒剂,它能分解体内过多的毒素,并经肝脏和肾脏的处理排出体外,当体内的毒素降低到一定的浓度时,脸上的斑点和青春痘就会慢慢消失。卵磷脂还具有一定的亲水性,并有增加血红素的功能,如果每天服用一定量的卵磷脂,就能为皮肤提供充分的水分和氧气,使皮肤变得光滑柔润。卵磷脂是人体每一个细胞不可缺少的物质,如果缺乏,就会降低皮肤细胞的再生能力,导致皮肤粗糙、有皱纹。如能适当摄取卵磷脂,皮肤再生活力就可以保障,再加上卵磷脂良好的亲水性和亲油性,皮肤当然就有光泽了。另外,卵磷脂所含的肌醇还是毛发的主要营养物,能抑制脱发,使白发慢慢变黑。

延缓衰老:人随着年龄增长,记忆力会减退,其原因与乙酰胆碱含量不足有一定关系。脑部的神经传导物质(乙酰胆碱)减少是引起老年痴呆的主要原因,乙酰胆碱是神经系统信息传递时必需的化合物。而且“胆碱”是卵磷脂的基本成分,卵磷脂的充分供应将保证机体内有足够的胆碱与人体内的乙酰结合为“乙酰胆碱”,从而成为大脑提供充分的信息传导物质,大脑能直接从血液中摄取卵磷脂及胆碱,并很快转化为乙酰胆碱。长期补充卵磷脂可以减缓记忆力衰退的进程,预防或推迟老年痴呆的发生。

调剂心理:经常补充卵磷脂,可使大脑神经及时得到营养补充,保持健康的工作状态,利于消除疲劳,激化脑细胞,改善因神经紧张而引起的急躁、易怒、失眠等症。

2)本实验有哪些步骤可以改进?

答:(1)做卵磷脂的溶解性试验时,丙酮滴加的量适当增加,现象会较明显;

   2)利用95%乙醇粗提卵磷脂时,可以分三次提取,效果较佳;

   3)三甲胺的检验时,氢氧化钠溶液的浓度或者用量可以尝试改变,以使检验现象较明显

七、注意事项

1)注意安全:本实验中的乙醚、丙酮及乙醇均为易燃药品。氯化锌具腐蚀性。

2)实验过程要细致,培养耐心。

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